Croissance microbienne et adhérence d'Escherichia coli dans les mousses de silicone élastomère avec des additifs couramment utilisés

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8541 (2023) Citer cet article

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Le silicone est souvent utilisé dans des environnements où la déperlance est un avantage. Le contact avec l'eau favorise l'adhésion des micro-organismes et la formation de biofilm. Selon l'application, cela peut augmenter le risque d'intoxication alimentaire et d'infections, l'apparence dégradante du matériau et la probabilité de défauts de fabrication. La prévention de l'adhésion microbienne et de la formation de biofilms est également essentielle pour les mousses élastomères à base de silicone, qui sont utilisées en contact direct avec le corps humain mais sont souvent difficiles à nettoyer. Dans cette étude, la fixation microbienne dans et la rétention des pores de mousses de silicone de différentes compositions est décrite et comparée à celles des mousses de polyuréthane couramment utilisées. La croissance de l'Escherichia coli gram-négatif dans les pores et leur lessivage pendant les cycles de lavage est caractérisée par la croissance/inhibition bactérienne, le test d'adhésion et l'imagerie SEM. Les propriétés structurelles et de surface des matériaux sont comparées. Malgré l'utilisation d'additifs antibactériens courants, nous avons constaté que les particules non solubles restent isolées dans la couche d'élastomère de silicone, affectant ainsi la microrugosité de surface. L'acide tannique soluble dans l'eau se dissout dans le milieu et semble aider à inhiber la croissance bactérienne planctonique, avec une indication claire de la disponibilité de l'acide tannique sur les surfaces des SIF.

Le silicone est un matériau bien étudié avec une large gamme d'applications. Néanmoins, ses propriétés antibactériennes dans des applications spécifiques soulèvent encore des questions. Dans les applications médicales, les mousses à base de silicone (SIF) sont principalement utilisées comme prothèses1 et pansements modernes2,3, en contact constant avec les tissus et les fluides corporels. Comme l'humidité ambiante et l'eau favorisent la formation de biofilms par l'adhésion de micro-organismes, de telles conditions augmentent sans aucun doute la possibilité d'infections. Un autre domaine d'application en croissance rapide pour les SIF est le rembourrage (sièges, matelas, joints), où un contact occasionnel avec des fluides corporels, des aliments et des liquides est hautement probable. Les mousses de rembourrage ont souvent une structure à cellules ouvertes, qui permet la pénétration de l'air, des fluides et des micro-organismes. Comme la formation de biofilm dégrade également l'apparence du matériau et augmente la probabilité de défauts de fabrication4,5, la prévention de l'adhésion microbienne et de la formation de biofilm sur les matériaux en silicone est un sujet important, indépendamment de leur application.

Les poly(diméthylsiloxanes), par exemple les polymères à base de PDMS, communément appelés silicones, ne sont pas intrinsèquement antibactériens. Des additifs tels que des catalyseurs, y compris des nanoparticules de platine6, et d'autres espèces de faible poids moléculaire incorporées entre les chaînes polymères ou greffées sur le squelette polymère peuvent conférer une activité antibactérienne au silicone7,8,9. Une faible tension superficielle et, par conséquent, une hydrophobicité élevée seraient l'une des principales raisons pour lesquelles le PDMS est sujet à l'adsorption des protéines et à l'adhérence bactérienne10,11. Par exemple, Buscher et al. ont comparé Candida albicans et C. tropicalis et constaté que plus la surface du micro-organisme est hydrophobe, plus il est enclin à adhérer à une surface en silicone4. Bien que la bactérie gram-négative Escherichia coli ait à la fois des régions hydrophobes et hydrophiles dans sa couche de membrane externe, sa surface est généralement considérée comme hydrophile (l'angle de contact pour le mouillage serait compris entre 16,7° et 24,7°)12,13. Il est généralement entendu que l'adhésion des microorganismes dépend des interactions hydrophobes entre la cellule bactérienne et la surface du polymère13.

Cherchant à supprimer l'adhésion des bactéries hydrophiles sur une surface hydrophobe, l'augmentation de l'hydrophilie de surface10,14,15 est souvent proposée comme solution possible. Il a été démontré que l'adhérence d'E. coli sur un cathéter en silicone diminue de 32 % en greffant un peptide antimicrobien et de la polyvinylpyrrolidone sur du PDMS durci, ou même jusqu'à ~ 95 % en utilisant de la méthylcellulose modifiée au vinyle16 et, en utilisant du carboxyméthylchitosane et de la polydopamine, une réduction ≥ 90 % de l'adhérence d'E. coli15. De plus, le greffage d'acrylates7 sur du caoutchouc de silicone (Pseudomonas, cathéter) supprime efficacement l'adsorption de protéines non spécifiques et l'adhésion cellulaire, supprimant la récupération hydrophobe de la surface. L'un des travaux les plus récents de McVerry et al. montre une modification de surface hydrophile en une étape réussie dans des conditions ambiantes et sous lumière UV pour créer un réseau de polysulfobétaïne et de perfluorophénylazide de polymère zwitterionique sur une surface de silicone17. L'activité antibactérienne rapportée était due à la formation de la couche d'hydratation de surface en présence du revêtement hydrophile.

Les modifications de surface mentionnées ci-dessus sont réalisées avec succès pour le silicone monolithique, lui permettant de traiter uniformément la surface du matériau. Cependant, il devient beaucoup plus difficile de greffer les SIF à cellules ouvertes hautement poreux et à faible densité dans toute la structure. L'immersion de grands volumes remplis d'air serait fastidieuse et prendrait du temps. De plus, lors du moulage, une peau partielle se forme au cours du processus de fabrication. Plus important encore, la nature hydrophobe est plutôt privilégiée pour éloigner l'eau de sa surface et de ses pores, en particulier dans les applications de rembourrage et d'isolation. Fonctionnaliser sa surface avec des groupes hydrophiles annulerait sa propriété de dissuasion de l'eau, agissant ainsi comme un matériau semblable à une éponge.

Pour conserver le caractère hydrophobe du matériau, il est possible d'ajouter des sites antibactériens locaux sous forme de particules, inhibant ainsi la croissance des micro-organismes. Ces particules peuvent partiellement faire surface lors de l'amincissement des parois des pores lors du processus de durcissement et de formation de mousse, mais restent incrustées dans le matériau. Un tel procédé de fabrication repose sur la polymérisation et la dispersion des composants et évite l'usure des additifs antibactériens.

Pour appliquer des propriétés antibactériennes au silicone, l'incorporation de différentes espèces d'argent (nanoparticules, sels, ions) est depuis de nombreuses années l'un des principaux axes de recherche18,19,20,21. En conjonction avec le silicone hydrophobe, les pansements pour plaies ont l'avantage d'extraire les bactéries des plaies et agissent simultanément comme bactéricides2. Les nanoparticules inorganiques, Ag, ZnO et TiO2 présentent une efficacité antibactérienne élevée contre E. coli, mais leur utilisation à des concentrations efficaces modifie considérablement les propriétés mécaniques20. Pour de grands volumes de matériau, plusieurs additifs et charges peu coûteux pourraient être incorporés dans la matrice de mousse. Par exemple, l'acide tannique22,23,24, la shungite25, le chitosane26, le mica et le zinc27 ont montré une activité antibactérienne.

L'activité microbienne sur les mousses de silicone a été étudiée principalement pour les pansements commerciaux2,19 par des tests qualitatifs (c.-à-d. inhibition de zone) et quantitatifs (test de viabilité bactérienne). Sous forme de poudre, une méthode d'agitation en flacon a été utilisée pour tester l'activité antibactérienne des SIF haute densité durcis au peroxyde, où l'effet antimicrobien repose sur les additifs toxiques s'échappant de la mousse (post-) durcie28. Pour différents pansements, les résultats des tests d'inhibition de zone ont été comparés à l'hydrophobicité de la surface du matériau poreux2. Pour les élastomères de silicone non moussés, il a également été démontré qu'une membrane poreuse non traitée ne révèle aucune activité bactériostatique ou bactéricide29.

Récemment, une méthode normalisée, ISO 23641:202130 a été publiée pour tester les polymères cellulaires flexibles basée sur la méthode de la fiole agitée et pourrait être utilisée comme guide pour évaluer l'efficacité antibactérienne. Dans certains cas, un processus simplifié pourrait être appliqué aussi efficacement.

Cette étude porte sur l'activité antimicrobienne dans les mousses de polysiloxane avec différents additifs minéraux et organiques, qui sont facilement disponibles et donc réalisables industriellement. À titre de comparaison, les mousses à base de polyuréthane (PU- ou PUR-) et leurs activités antibactériennes sont évaluées, car le PU est le matériau le plus largement utilisé dans les applications mentionnées précédemment et bien d'autres. Il existe des recherches approfondies sur la mousse PU et ses additifs antimicrobiens (dans les pansements19, les membranes31, les composites31 et les revêtements31), mais pour les SIF, de nombreuses questions de recherche restent sans réponse car ce domaine est en constante évolution. Plus important encore, les deux matériaux sont appliqués comme couches de rembourrage dans les sièges et les matelas. Alors que les mousses de silicone élastomère suscitent de plus en plus d'intérêt pour le rembourrage, l'amortissement des vibrations, l'isolation32 et les applications médicales, le réglage de leurs propriétés antimicrobiennes ajoute de la valeur à leur nature déjà superbe.

Cette expérience montre comment les différents additifs dans la mousse et la différence de matériau de base affectent la croissance bactérienne dans la suspension d'inoculation en 24 h à 25 °C. Les concentrations résultantes d'E. coli dans le milieu Luria-Bertani (bouillon LB) entourant les cubes de test sont illustrées à la Fig. 1. Comme le cube de mousse est immergé dans le milieu, il est librement perméable aux bactéries et au milieu porteur. La concentration d'E. coli devrait différer du milieu de croissance pur sans cube et autour des cubes proposant un effet antibactérien. Pour cela, les mêmes tests ont été réalisés pour un mélange d'inoculation pur (Sans mousse) et une mousse silicone standard sans additifs antibactériens (SIF) pour l'expérience contrôle.

Les variations des concentrations d'E. coli dans le milieu de croissance entourant les échantillons de cubes et dans le milieu sans échantillon de mousse. Une différence significative par rapport à un SIF standard peut être observée pour SIF-CHI (mousse de silicone avec additif chitosane) et SIF-TAN (mousse de silicone avec additif acide tannique). De plus, les deux mousses à base de PUR présentent des concentrations plus élevées d'E. coli dans le milieu de croissance par rapport aux autres SIF (sauf SIF-AC avec additif de charbon actif). SIF-MeC - mousse de silicone avec additif de méthylcellulose, SIF-SHU - avec additif de shungite, PUR-EG/APP - mousse de polyuréthane avec additif de graphite exfolié et de polyphosphate d'ammonium. Les abréviations utilisées dans cette figure et les propriétés des mousses préparées sont résumées dans le tableau 1.

Les résultats montrent que la concentration d'E. coli (c[CFU]) dans le milieu de croissance était la plus élevée autour des SIF avec additif de charbon actif (SIF-AC). Par rapport au SIF vierge (sans additif), la concentration d'E. coli (CFU/ml) dans le milieu de croissance environnant du SIF-AC est trois fois plus élevée. Cette différence significative de c[CFU] suggère que l'additif de charbon actif hydrophile augmente la concentration du milieu de croissance autour des cubes de mousse. Le charbon actif est décrit comme un adsorbant pour lier les molécules des liquides par les forces de van der Waals, provoquant une concentration plus élevée d'adsorbat à l'interface que dans le fluide en vrac33. Par conséquent, l'effet sur c[CFU] dans les milieux de croissance autour de SIF-AC pourrait résulter de l'augmentation de la fixation des bactéries sur la surface des pores de la mousse, qui est également visible sur les images SEM (Scanning Electron Microscope) (section Bacterial population formations). Bien que la nature hydrophile et hydrosoluble de la méthylcellulose lui permettrait de diffuser à partir du composite polymère et de se dissoudre dans LB, son inclusion dans la matrice SIF (dans SIF-MeC) n'a pas d'effet significatif sur l'inhibition de la croissance bactérienne dans le milieu par rapport au SIF vierge. Un milieu de croissance sans mousse a entraîné une diminution de 1/3 logs de c[CFU] par rapport à l'échantillon de mousse SIF, ce qui suggère que la présence d'un cube de mousse SIF augmente la concentration d'E. coli/LB en 24 h à 25 °C.

Les suspensions d'inoculation autour de SIF-SHU, avec un additif de shungite, ont entraîné des c[CFU]-s inférieurs à ceux du SIF vierge, bien qu'il soit essentiel de noter que les plages d'écart type se chevauchent ; par conséquent, la différence peut ne pas être significative. Comme la shungite aurait des propriétés antibactériennes en milieu aqueux, nous nous attendions à un effet sur c[CFU]25. Les SIF qui entravent considérablement la croissance d'E. coli à 25 ° C sont SIF-CHI et SIF-TAN. Comparé aux SIF vierges, l'additif de chitosane hydrophile dans SIF-CHI semble avoir un effet distinct dans l'inhibition de la croissance bactérienne dans le milieu. Comme le chitosane est insoluble dans l'eau, sa dissolution du polymère n'est pas attendue. Sa saillie de la surface à un certain degré ou sa disponibilité à partir des côtés coupés de la mousse est possible. D'après des recherches antérieures de Qin et al., le chitosane insoluble dans l'eau montre un effet inhibiteur contre E. coli en raison de l'eau agissant comme un milieu acide34. Pour SIF-TAN, pendant la période d'inoculation, une décoloration détectée visuellement du milieu de croissance indique une fuite d'acide tannique (AT) dans le milieu. La fuite est encore favorisée en coupant l'échantillon et en exposant le TA à la solution. Le TA étant une substance moléculaire hautement soluble, la diffusion vibrationnelle des molécules à partir d'un réseau de polymères réticulés hydrophobes et leur dissolution dans un milieu aqueux sont possibles35. L'échantillon de mousse SIF-TAN a produit le meilleur effet antibactérien parmi les autres mousses dopées à l'additif dans ce test, ce qui a entraîné un c[CFU] inférieur de 0,5 log à celui du SIF vierge.

En général, l'adhésion cellulaire aux surfaces hydrophobes a été décrite précédemment par McVerry et al. en raison de la nature non polaire du PDMS et de l'augmentation significative de l'effet antibactérien lorsque sa surface est modifiée en hydrophile17. Comme la surface du PUR est naturellement hydrophobe36 mais moins hydrophobe que le silicone, l'adhésion et la croissance bactériennes dans le milieu environnant sont attendues lorsqu'il est possible d'utiliser la surface du matériau pour la fixation et la multiplication. Les mesures d'angle de contact (voir Données supplémentaires S1) montrent que bien que SIF et PUR soient tous deux hydrophobes (Θ > 90°), la goutte d'eau mouille les surfaces PUR et PUR-EG/APP plus efficacement que les surfaces SIF et SIF-AC. Nous avons observé que le mouillage augmentait dans le temps du fait de la nature poreuse des mousses.

Malgré une différence de 0,5 log de c[CFU] entre les SIF et les PUR, nous devons également tenir compte de la structure de la mousse. Près de densités de mousse similaires, les micrographies SEM révèlent des vides comparativement plus grands dans les PUR, ce qui suggère que les bactéries ont moins de surface à laquelle adhérer et, par conséquent, se multiplier. De plus, le mouvement vigoureux du milieu lors de l'agitation pourrait entraver l'adhésion des bactéries. Les images correspondantes comparant les structures en mousse se trouvent dans l'annexe en ligne S1 de ce manuscrit.

Les échantillons, qui ont été inoculés dans E. coli/LB pendant 24 h à 25 ° C (180 tr/min), ont été lavés dans 1 × PBS pendant cinq cycles séquentiels pour évaluer le comportement d'adhérence-détachement des cellules bactériennes des pores (cellules planctoniques) et des parois des pores (cellules adhérées). Les résultats suivants sur les figures 2A, B indiquent comment différents matériaux affectent l'adhésion et la croissance bactériennes et si l'additif antibactérien a un effet à l'intérieur de la mousse. Dès le premier lavage (lavage I), la lixiviation cI[CFU] est en corrélation avec la c24h[CFU] étant la plus élevée pour les polyuréthanes et la plus faible pour SIF-TAN/SIF-CHI. La comparaison des c[CFU] des milieux de lavage montre qu'une partie relativement importante des bactéries s'échappe avec le 1er lavage indiquant que la majorité est planctonique, par exemple flottant à l'intérieur de la mousse. La somme des bactéries éliminées de la mousse ne nous donnerait pas le nombre total de bactéries à l'intérieur du matériau, car toutes les cellules ne sont pas libérées en cinq lavages. Pourtant, les lavages ultérieurs (du lavage II à V) révèlent plus de bactéries présentes au total que dans le milieu environnant.

Extraction des bactéries des cubes via des cycles de lavage : concentrations d'E. coli dans les milieux de lavage séquentiel (UFC/ml de PBS). Les mousses à base de silicone (A) sont séparées des mousses de polyuréthane (B) en raison de la différence de structure des pores, ces dernières ont des vides nettement plus importants et l'échange du milieu est favorisé.

Une pente plus raide au début de la Fig. 2 représente l'extraction de cellules viables lâches (planctoniques). Nous suggérons que le plateau peu profond à la fin des courbes (lavages III, IV et V) pourrait indiquer le détachement lent des cellules adhérées des pores (Fig. 2A). Les courbes les plus raides des lavages I-III projettent bien la structure hautement poreuse du PUR et du PUR-EG/APP, permettant un passage plus rapide de la suspension. Contrairement aux PUR, les bactéries sont plus difficiles à extraire des SIF. Les mécanismes possibles comprennent l'adhésion plus probable aux surfaces plus hydrophobes et l'obstruction de la taille des pores plus petite, ce qui réduit le taux d'échange de liquide pendant les lavages. Comme le SIF-TAN avait la plus faible concentration d'E. coli dans le milieu de croissance environnant après 24 h d'incubation, la courbe de plateau précoce est attendue en raison du nombre initial de bactéries présentes et de l'effet antibactérien dû à la fuite de TA dans la solution.

Nous voulions également savoir s'il y avait une croissance bactérienne significative dans le cube de mousse ou si les résultats des lavages étaient simplement l'effet de l'adhérence. Une possibilité était de comparer si la fixation/adhésion d'E. coli est affectée par la durée d'inoculation. Les différences entre les inoculations à court terme (0 h, lavage immédiat) et à long terme (24 h) ont été analysées et le résumé est illustré à la Fig. 3A.

(A) Libération de bactéries à partir de mousses SIF vierges à différentes durées d'inoculation : mousse inoculée pendant 24 h et mousses lavées immédiatement après l'étape d'inoculation (pas d'additifs antibactériens). (B) Cette expérience montre les différences de concentrations résultant de différentes conditions de croissance. Dans les expériences menées en 'AIR', il n'y a pas de bouillon en excès et pas d'aération/d'agitation supplémentaire. Après la période de 24 h, les SIF standard inoculés ont été analysés pour les concentrations d'E. coli (CFU/ml).

Comme précédemment, la courbe plus raide nous permet de supposer que plus de bactéries sont lâches (planctoniques) et moins adhérentes. Comme prévu, une période plus longue a permis aux bactéries de se développer mais aussi d'interagir avec la surface du matériau en mousse. Les courbes de lavage après une période d'incubation de 24 h montrent une élimination plus lente des pores que pour les bactéries immédiatement lavées. Un tel plateau pourrait indiquer un comportement de détachement progressif du matériau hydrophobe.

Pour illustrer l'effet de croissance dans des conditions de faible humidité, ainsi qu'en manque de nutriments, nous avons effectué un test dans un environnement fermé à 25 ° C sans bouillon supplémentaire ni agitation, suivi de cinq lavages ultérieurs (test AIR, Fig. 3B). Par rapport à la méthode précédemment utilisée dans cette recherche, qui est l'incubation dans un flacon et un milieu LB en excès, l'élimination des bactéries des échantillons de mousse se traduit par des courbes quelque peu similaires de concentrations de lavage, indiquant que lorsque les bactéries ont suffisamment de temps pour se développer et se multiplier, il y a suffisamment de temps pour adhérer à la surface du matériau.

Toutes les mousses de silicone utilisées dans cette étude sont des mousses à base de polysiloxane élastomère à cellules ouvertes. Les mousses ont été préparées en utilisant des charges générales non antibactériennes réparties dans les prépolymères. De telles particules de charge sont visibles sous la couche de polymère (voir Fig. 4A) d'un SIF vierge. La surface avec des additifs antibactériens ne diffère que légèrement du SIF vierge visuellement par la rugosité de surface et la distribution des particules, comme on le voit sur l'image du milieu (Fig. 4B, SIF-MeC). Bien que les charges générales utilisées dans les compositions SIF n'aient pas été utilisées pour le PUR standard et le PUR-EG / APP, les particules EG ou APP utilisées dans cette composition n'ont pas été visiblement détectées dépassant de la surface (Fig. 4C).

Pour un SIF sans additifs antibactériens spécifiques, les particules de charge générales distinguables à l'intérieur des parois de la mousse sont recouvertes d'une fine couche de polymère en raison de l'augmentation de la tension superficielle (image A). Pour le SIF-MeC, l'additif augmente la rugosité de surface, restant toujours sous la couche de polymère (image B). La surface lisse et la structure creuse de PUR-EG/APP offrent moins de surface à adhérer (image C).

Les additifs à vocation antibactérienne constituent une partie relativement importante du prémélange, variant de 0,3 à 5,0 % en poids. Les dimensions spatiales des particules par rapport à l'épaisseur de la paroi des pores devraient leur permettre de faire surface/saigner pendant le processus de soufflage et l'amincissement de la paroi qui en résulte. Par conséquent, nous nous attendons à ce qu'ils affectent la croissance bactérienne lors d'un contact partiel ou direct avec des bactéries lorsque l'additif peut perturber la membrane cellulaire provoquant la lyse et la mort des cellules15.

Cependant, il est possible qu'en raison des conditions de synthèse et des paramètres de mousse qui en résultent (épaisseur de paroi, teneur en additif et dimensions des particules, mais surtout, tension superficielle), ces particules ne fassent pas entièrement surface, et la majorité reste recouverte d'une fine couche de polymère. Pour confirmer ce phénomène, nous avons effectué une analyse EDX sur la surface des SIF en nous concentrant sur 20 zones différentes pour acquérir la composition élémentaire de la surface. La distribution des éléments (Si, C) est représentée sur les cartes élémentaires obtenues par la technique SEM-EDX (Fig. 5).

Les cartes élémentaires d'analyse SEM – EDX de la section transversale du squelette de la mousse SIF-SHU et de la surface des pores montrent une distribution uniforme de Si, indiquant que du silicone est présent à la surface des particules de charge. La carte élémentaire de la section transversale révèle des zones particulières à forte densité de carbone, qui correspondent aux particules de remplissage vues dans les images SEM. La carte élémentaire Si montre que le silicone est présent sur les particules de charge dans une certaine mesure. Pour SIF-CHI, les compositions élémentaires étaient les suivantes : C 61,2, O 6,3, Si 32,5 % en poids et C 76,7, O 5,9, Si 17,4 % atomique. Pour SIF-SHU, les compositions élémentaires étaient : C 48,9, O 28,8, Si 22,3 % en poids et C 61,0, O 27,0, Si 11,9 % atomique.

Les résultats de l'imagerie compositionnelle suggèrent que les particules sont bien incorporées dans les prépolymères de silicone, laissant des chaînes polymères enchevêtrées à la surface des additifs. Par exemple, les zones de shungite denses en carbone dans la matrice polymère sont représentées en obtenant le spectre EDX. Les détails des spectres EDX des valeurs de surface des SIF mesurées en pourcentages atomiques et en poids sont répertoriés sous les images de la Fig. 5. Bien que la composition élémentaire des additifs utilisés soit principalement C et H, les résultats SEM – EDX pour SIF-CHI montrent également une faible concentration d'azote à la surface des pores.

Parmi tous les échantillons observés, après la période d'incubation de 24 h (sans lavage), les bactéries ont tendance à se localiser dans différentes formations structurelles à la surface des SIF. Une distribution uniforme d'E. coli adhérant n'est observée que sur les SIF et SIF-AC vierges (Fig. 6), ce qui suggère qu'il y a moins ou pas d'effet perturbateur pour l'adhésion bactérienne favorisée par la caractéristique de surface hydrophobe du silicone. Les bactéries ont également adhéré aux sites où les charges sont présentes, sans aucun comportement distinctif visible sur ou autour (Fig. 6, image centrale supérieure).

Répartition uniforme d'E. coli sur les surfaces de SIF (images A–D) et SIF-AC (E,F). Plusieurs E. coli sont présents au-dessus du polymère, en dessous desquels le polymère recouvre les particules de charge (images B, C). La formation de pili est visible sur SIF vierge (image D). Pour les SIF avec du charbon actif, les bactéries forment des zones agglomérées qui sont une formation distinctement différente des surfaces SIF standard.

Le charbon actif à grande surface est considéré comme hydrophile (plus la surface est élevée, plus l'hydrophilie est élevée) et à haute capacité d'adsorption33. Nous avons trouvé des bactéries réparties uniformément sur les surfaces des pores dans toutes les mousses avec additif AC et certaines colonies/agglomérations plus importantes sur des sites uniques. La formation de pili, qui sont principalement responsables de l'attachement lors de la conjugaison, permettant la liaison aux surfaces solides, est la preuve de conditions propices pour que les bactéries gram-négatives partagent l'information génétique et se multiplient (Fig. 6, image centrale en bas). Les pili étaient rares dans ces formations étalées mais plus probables dans les formations en grappes de colonies.

En plus des formations similaires sur SIF et SIF-AC, nous avons remarqué un comportement distinctif dans des groupes d'additifs insolubles dans l'eau (shungite, chitosan) et d'additifs hydrosolubles (acide tannique, méthylcellulose). Bien que la shungite ait du carbone dans différentes modifications et soit insoluble, elle apporte certains composants dissolvants qui présentent des propriétés antibactériennes25,37. L'analyse SEM révèle que les bactéries ne se trouvent que dans les pores les plus externes de l'échantillon SIF-SHU, laissant les pores internes presque exempts de bactéries (Fig. 7). La fuite de tels composants du squelette expliquerait l'absence de bactéries adhérées dans la mousse. Initialement, la concentration de particules dissoutes dans la suspension d'inoculation est plus faible autour du cube où la concentration en E. coli est relativement élevée (30,5 ml de suspension totale d'inoculation, dont < 2,7 ml dans le cube).

En raison de la dissolution des composants de la shungite, les bactéries ne se trouvent que dans les pores les plus externes de l'échantillon SIF-SHU (images B, C). Dans les pores les plus externes, on trouve des formations bactériennes agglomérées. Les images (A) et (B) sont des répliques des différentes zones du même échantillon, et l'image (C) est un grossissement de l'image (B).

Les échantillons avec un additif de chitosane insoluble (SIF-CHI) montrent une distribution inégale d'E. coli adhérant (Fig. 8). Nous n'avons trouvé que quelques micro-organismes dans certains pores, et les pores plus proches des côtés de l'échantillon étaient inégalement peuplés. Encore une fois, certaines bactéries étaient présentes car de grands amas/agglomérats étaient présents (Fig. 8, image A), qui peuvent avoir été des formes planctoniques avant l'extraction supercritique. Aucune distribution de ce type, comme on l'a vu pour le SIF vierge (Fig. 6) et le SIF-AC (Fig. 6), n'a été trouvée.

Les mousses dopées au chitosane (SIF-CHI) ont montré une distribution inégale d'E. coli à la surface des pores. Sur les images (A–C), certaines zones sont occasionnellement peuplées, et certaines sont propres sans certaines formations. Les images (A–C) sont des répliques du même échantillon observé.

Dans cette recherche, nous avons constaté que l'effet antibactérien de la méthylcellulose (dans SIF-MeC) à la surface du matériau est similaire au chitosane (dans SIF-CHI) (Fig. 9B, C), mais son effet antibactérien est négligeable dans le milieu de croissance (Fig. 1). Ce dernier indique que la méthylcellulose et le chitosan affectent l'adhésion des bactéries dans les pores de la mousse de silicone.

La formation de différentes structures sur les surfaces des SIF avec des additifs hydrophiles : des bactéries sous forme de formations en couches dans le SIF-AC (A), parfois des bactéries adhérentes distribuées dans le SIF-MeC sur une surface avec une rugosité visiblement accrue (B) et de gros amas de bactéries dans les pores du SIF-CHI (C).

Il est intéressant de noter qu'aucune adhérence bactérienne telle que décrite ci-dessus n'était visible sur les surfaces des pores dans la mousse avec l'additif d'acide tannique (TA). Pendant la période d'incubation avec une aération vigoureuse (180 tr/min), du TA très soluble (solubilité : 2850 g/L d'eau, 1,7 mol/L) s'est échappé de la mousse, détectable par la décoloration de la suspension du jaune au jaune brunâtre. Comme les échantillons ont été lyophilisés avant l'inoculation, certaines particules de TA peuvent s'être détachées et découvertes. Dans les images SEM respectives (SIF-TAN), nous n'avons trouvé aucune bactérie sur les parois des pores (Fig. 10). Dans SIF-TAN, les pores sont interconnectés et, compte tenu de la taille d'E. coli (2 à 5 µm), les bactéries ont pu flotter librement dans l'espace vide du cube de mousse avec le milieu liquide. Comme il n'y a pas de colonisation de surface visible, nous supposons que les bactéries fuyant lors des lavages flottaient et se multipliaient dans la suspension d'inoculation (par exemple en restant planctoniques). Le mode de vie planctonique des micro-organismes dans des conditions similaires a également été suggéré par Tan et al.38.

Absence de bactéries à la surface d'un pore dans SIF avec un additif TA à 0,5% en poids. Dans les images (B) et (C), aucun E. coli n'est présent, mais des résidus de particules de charge peuvent être trouvés sur la surface des pores. Les images (A) et (B) sont des répliques des différentes zones de l'échantillon, et l'image (C) est un grossissement de l'image (B).

Par rapport aux SIF, les PUR à faible densité analysés (PUR et PUR-EG) avaient une surface significativement inférieure à laquelle adhérer et la structure est plus creuse (Fig. 11, rangée supérieure). Fait intéressant, des ponts filiformes à partir du matériau PU se sont formés sur les bords des pores pendant le processus de moussage et de durcissement, là où la plupart des E. coli se sont attachés. Au fur et à mesure que le milieu d'inoculation/de croissance s'écoule à travers les canaux, les bactéries planctoniques adhèrent à ces sites, ce qui conduit à l'assemblage de colonies plus grandes. Nous n'avons trouvé aucune preuve d'une telle activité dans les SIF. Pour les mousses PUR-EG, mousses de polyuréthane ignifuges avec EG (graphite exfoliant) et APP (polyphosphate d'ammonium), nous avons remarqué que la plupart/toutes les bactéries formaient de grandes colonies et presque aucune à la surface du matériau cellulaire (Fig. 11, rangée du bas). Ces formations sont adjacentes les unes aux autres. Comme pour le PUR, E. coli a également adhéré aux ponts matériels des pores d'interconnexion.

Les mousses de polyuréthane (PUR, images A–C et PUR-EG/APP, images D–F) ont une structure creuse distinguée. La majorité des bactéries a adhéré aux formations filiformes à travers les vides des pores (images A, B, F). Pour les PUR en général, on trouve plusieurs grandes formations bactériennes d'E. coli qui ne sont pas répandues dans les SIF.

Les échantillons de mousse utilisés dans les tests ont été préparés par un procédé de moulage par injection. Des additifs sélectionnés ont été introduits dans des compositions de silicone pour évaluer l'effet des additifs sur la croissance bactérienne dans les mousses, par opposition à une surface plane non poreuse.

Pour la synthèse SIF, des mélanges de prépolymères ont été préparés à l'aide de poly(diméthylsiloxanes) à terminaison vinyle et hydroxyle (5000 cSt), de poly(méthylhydro)siloxane fonctionnalisé à 100 % (25–35 cSt) et de catalyseur de Karstedt (platine(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tétraméthyldisiloxane, 0,05 % Pt) obtenus auprès de Hub ei Chem et eau de qualité MilliQ. Le modérateur SIT7900.0 (1,3,5,7-tétravinyl-1,3,5,7-tétraméthylcyclotétrasiloxane) et la silice fumée traitée HMDZ SIS6962.0 (LOT # 11698972251) ont été obtenus auprès de Gelest Inc, et le mica muscovite de OMYA, Norvège (fourni par Virk OÜ, utilisé tel que reçu).

Les densités de mousse à cellules ouvertes résultantes étaient comprises entre 80 et 175 kg/m3 et ont été découpées en morceaux rectangulaires de 1,3 × 1,4 × 1,5 cm3 (volume de 2,7 cm3). La porosité de la mousse a été calculée à partir de la densité de la mousse en considérant que la densité apparente du composite de silicone était de 1 g/cm3. A titre de référence, deux mousses de polyuréthane issues de la production industrielle d'Estelaxe OÜ ont été comparées selon la même méthode. La liste des mousses d'essai se trouve dans le tableau 1, qui est accompagné d'informations structurelles sur les molécules d'additifs organiques dans la figure 12.

Structures moléculaires du chitosane (A), de la méthylcellulose (B) et de l'acide tannique (C).

Organisme d'essai La souche Nissle d'Escherichia coli (E. coli) a été utilisée dans toutes les expériences. Le bouillon nutritif Luria – Bertani (LB) et la solution saline tamponnée au phosphate 0, 1 M (1XPBS) ont été préparés par l'Institut de technologie de l'Université de Tartu. La solution de formaldéhyde (37 %) pour la fixation des cellules a été obtenue auprès de Panreac AppliChem. Estelaxe OÜ a fourni les échantillons de mousse à base de PU et les échantillons à base de polysiloxane ont été synthétisés en interne.

Les mélanges de prépolymères ont été préparés à l'aide d'un mélangeur autonome avec une lame rotative recouverte de PTFE. Les composants des pré-mélanges ont été séparés en deux parties distinctes, l'une contenant le catalyseur et le modérateur, l'autre contenant l'hydrure en plus d'autres pré-polymères fonctionnalisés. Les deux composants ont été mélangés séparément, puis mélangés et injectés par un dispositif de moulage par injection conçu en laboratoire, distribuant un volume total de 500 ml de prémélange par échantillon de mousse.

Une anse de culture d'E. coli a été transférée dans le bouillon LB standard dans un flacon en verre, scellé avec un bouchon métallique stérilisé à la flamme. La suspension de cellules E. coli préparée a été incubée pendant 20 h à 37 ° C, à une vitesse d'agitation de 180 tr/min.

Avant l'inoculation, une stérilisation des échantillons de mousse a été effectuée dans une étuve à vide (Memmert) à 200 ° C et 3 mbar pendant 60 min dans l'erlenmeyer avec un bouchon en aluminium comme joint pour éviter la contamination aéroportée. Un mélange de 30 ml de milieu LB stérile et de 0,5 ml de pré-culture d'E. coli a été préparé pour inoculer les échantillons de mousse. La concentration initiale du milieu de croissance était d'environ (0,5…1) × 108 UFC/ml, déterminée en étalant des dilutions et en comptant les colonies en triple exemplaire. La mousse de silicone utilisée dans cette recherche avait une faible densité (85–175 kg/m3), de petits pores (diamètre < 1 mm) et était de nature hautement hydrophobe. Ainsi, il était nécessaire de désaérer les échantillons de mousse en les immergeant et en les pressant dans le mélange E. coli/LB préparé pour permettre aux bactéries de s'écouler à travers la structure ouverte. La compression a été effectuée avec des pincettes métalliques stérilisées à proximité de la flamme pour tuer les bactéries en suspension dans l'air. Les flacons contenant les échantillons et la suspension E. coli/LB ont été agités pendant 24 h à 25 °C et 180 tr/min.

Tout d'abord, des aliquotes ont été prélevées dans le milieu de croissance de 24 h entourant les cubes de mousse. De plus, une série de lavages a suivi pour extraire les bactéries de l'échantillon de mousse. Chaque cube de mousse a été transféré dans un flacon Erlenmeyer stérile contenant 30 ml de 1 × PBS (solution saline de tampon phosphate) et suivi d'un cycle de lavage de 10 min à 25 ° C et 180 tr/min. Pour une analyse plus approfondie, un échantillon de chaque lavage (PBS et bactéries extraites) a été prélevé. Cette étape a été répétée jusqu'à ce que 5 lavages aient été effectués.

Nous avons analysé tous les milieux de croissance initiaux de 24 h et les milieux de lavage ultérieurs pour déterminer les concentrations bactériennes. La DO600 a été évaluée par un spectrophotomètre UV/VIS (Ultrospec 7000, Biochrom) pour évaluer la densité cellulaire des échantillons de lavage. Les échantillons ont été dilués en série dix fois à chaque étape en utilisant 1 × PBS. 100 µL de dilutions ont été étalés sur la plaque LB Agar et incubés pendant une nuit à 37 °C. Les colonies bactériennes ont été comptées et les concentrations initiales ont été calculées en tenant compte des facteurs de dilution spécifiques. L'activité/efficacité antibactérienne peut être observée par le rapport réduit de bactéries compte tenu de la concentration bactérienne de l'inoculum sans mousse.

Pour chaque composition spécifique, un ensemble de cubes de mousse a été retiré des suspensions d'inoculation après 24 h. Les cubes ont été immergés dans du formaldéhyde à 3, 7% dans une solution de PBS 1 × pour la fixation des cellules et conservés à + 4 ° C pour une analyse plus approfondie. Un échange par étapes de la solution FA/PBS dans les pores de la mousse contre de l'éthanol (99,5 %) a été effectué, par exemple une déshydratation en série. Les échantillons de mousse ont été conservés dans chaque solution pendant au moins 2 h - dans 40, 50, 60, 70, 80, 90 et 96 vol% d'éthanol. De plus, une nuit dans de l'éthanol à 99,5% en volume et un autre à 99,5% en volume pour le stockage.

Le processus d'extraction au CO2 supercritique, étape nécessaire à la préparation des cellules pour l'imagerie, a été réalisé à l'aide d'un séchoir à point critique (E3100, Quorum Technologies) et d'un thermostat (Proline RP 1845, LAUDA). Pour l'imagerie des coupes transversales sous SEM (Hitachi TM3000, 15 kV), les échantillons ont été lyophilisés à l'aide d'un scalpel et recouverts d'une couche d'or de 7,5 nm.

La technique SEM-EDX a été appliquée pour cartographier la distribution élémentaire et acquérir la composition de surface des matériaux en mousse. Pour EDX, SwiftED3000 (Oxford Instruments) a été utilisé en combinaison avec SEM (Hitachi TM3000). Les compositions élémentaires ont été analysées en collectant des données à partir de 20 points, et les résultats ont été moyennés.

L'hydrophilie des matériaux en mousse a été évaluée en mesurant l'angle de contact formé entre les gouttelettes d'eau et la surface de la mousse polymère et la couche en forme de peau qui se forme lors du moulage. A cet effet, des gouttes d'eau ont été montées sur trois zones différentes. Les résultats sont la valeur moyenne de trois mesures sur différentes parties de film polymère. Les résultats sont résumés dans le Supplément S1.

L'activité antibactérienne de différentes mousses de silicone par rapport aux mousses de polyuréthane a été évaluée en inoculant les mousses avec E. coli Gram négatif, l'un des organismes pathogènes les plus courants trouvés dans les matelas et les coussins de siège. Différents fluides, généralement accompagnés de micro-organismes, sont susceptibles de pénétrer dans les pores du matériau lors de la compression répétitive qui caractérise leur application. Par conséquent, la méthode quantitative que nous avons appliquée convient pour décrire la croissance bactérienne dans des structures élastiques et tridimensionnelles dans des conditions où un excès de milieu porteur est disponible et où les bactéries planctoniques sont libres d'adhérer à la surface.

Nous nous sommes concentrés sur la comparaison de l'activité antimicrobienne des additifs naturels disponibles dans le commerce et à faible coût intégrés dans la matrice polymère, car il est quelque peu fastidieux d'immerger ou de tremper le produit final. Les conclusions suivantes peuvent être tirées des résultats de cette étude :

Alors que la majorité de la membrane externe d'E. coli est hydrophile, la combinaison de l'hydrophobicité partielle et de la microrugosité de surface SIF est suffisante pour permettre la fixation des bactéries;

L'effet antimicrobien, ou son absence, pourrait s'expliquer par la fine couche de polymère recouvrant les particules d'additif censées agir comme des sites antibactériens ;

Bien que les particules d'additif soient recouvertes d'une fine couche de silicone, les additifs hydrophiles insolubles dans l'eau incorporés dans les prépolymères affectent la fixation d'E. coli sur la surface de la mousse par une rugosité de surface accrue ;

Les additifs solubles dans l'eau, tels que l'acide tannique, présentent un effet antibactérien considérable lorsqu'ils se dissolvent à partir de la matrice polymère ;

Au cours de la période d'incubation de 24 h, la bactérie gram-négative E. coli est plus susceptible d'adhérer à la surface de l'élastomère à base de polysiloxane qu'à la mousse à base de polyuréthane. Cependant, la concentration bactérienne dans le milieu environnant du polysiloxane vierge est plus faible que pour un polyuréthane standard.

Nous concluons que l'utilisation d'additifs naturels à faible coût sans trempage mais incorporation initiale dans la matrice polymère permet d'éviter la formation de biofilm microbien à la surface des mousses de silicone. Pour des recherches futures, il serait essentiel d'analyser les variations de teneur en charge dans la plage où les propriétés mécaniques de l'élastomère sont acceptables pour une application souhaitée.

Les ensembles de données soutenant les conclusions de cet article sont inclus dans l'article et ses fichiers supplémentaires. Les images SEM supplémentaires utilisées et/ou analysées au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette recherche faisait partie d'un projet de développement soutenu par SA Archimedes (Grant No. 2014-2020.4.02.19-0155), du 08 mai 2019 au 07 mai 2022. Nous remercions Marje Kasari pour ses précieuses idées dans le choix de la méthodologie.

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Uno Mäeorg

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Peeter Piirimagi

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IR était responsable de l'enquête et de l'analyse formelle des résultats et de la rédaction du manuscrit. IR et KJL ont préparé les échantillons, TT, HP, IS et IR étaient responsables du développement de la méthodologie, TT, TT, HP, UM et UJ ont conceptualisé et supervisé les travaux de recherche, et TT et PP ont fourni les ressources. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Ingrid Rebane.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

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Reçu : 30 janvier 2023

Accepté : 15 mai 2023

Publié: 26 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35239-9

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