Le gène de résistance à la rouille noire du blé Sr43 code pour une protéine kinase inhabituelle

Nature Genetics (2023)Citer cet article

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Pour protéger le blé tendre contre les ravageurs et les maladies, les sélectionneurs ont introduit plus de 200 gènes de résistance dans son génome, doublant ainsi presque le nombre de gènes de résistance désignés dans le pool génétique du blé1. L'isolement de ces gènes facilite leur accélération dans les programmes de sélection et leur incorporation dans des piles de polygènes pour une résistance plus durable. Nous avons cloné le gène de résistance à la rouille de la tige Sr43, qui a été croisé avec du blé tendre provenant de l'herbe sauvage Thinopyrum elongatum2,3. Sr43 code pour une protéine kinase active fusionnée à deux domaines de fonction inconnue. Le gène, qui est unique aux Triticeae, semble être né d'un événement de fusion de gènes il y a 6,7 à 11,6 millions d'années. L'expression transgénique de Sr43 dans le blé a conféré des niveaux élevés de résistance à un large éventail d'isolats de l'agent pathogène responsable de la rouille de la tige, soulignant la valeur potentielle de Sr43 dans la sélection et l'ingénierie de la résistance.

Dans le monde, environ 20 % de la production prévue de blé panifiable (Triticum aestivum) est perdue chaque année à cause des ravageurs et des maladies4. Le déploiement de la variation génétique pour la résistance aux maladies est un moyen durable et respectueux de l'environnement de protéger les cultures de blé5. Depuis plus de 100 ans, les sélectionneurs ont réalisé de nombreux croisements pour enrichir le patrimoine génétique du blé avec des gènes de résistance. Notamment, plus de 200 des 467 gènes de résistance actuellement désignés dans le blé panifiable cultivé ont leur origine en dehors du pool génétique du blé panifiable1. Cependant, le déploiement de ces gènes de résistance interspécifique est souvent entravé par la traînée de liaison, c'est-à-dire la cointroduction d'allèles délétères à partir de gènes liés. De plus, les gènes de résistance uniques ont tendance à être rapidement surmontés par l'émergence de souches pathogènes brisant la résistance6. Le clonage de gènes de résistance individuels permettrait leur introduction sous forme de piles de polygènes génétiquement modifiés, susceptibles de fournir une résistance plus durable7.

La plupart des ~291 gènes de résistance aux maladies des plantes clonés à ce jour codent soit pour des récepteurs intracellulaires de la classe des liaisons aux nucléotides et des répétitions riches en leucine (NLR), soit pour des protéines extracellulaires de type récepteur ancrées à la membrane (RLP, appelées RLK lorsqu'elles contiennent une kinase intracellulaire). ) (tableau complémentaire 1)1,8. Un nouveau groupe de gènes de résistance a récemment été découvert, dont les membres codent pour deux protéines kinases fusionnées en une seule protéine. Ces gènes de kinases en tandem comprennent Rpg1, Yr15, Sr60, Sr62, Pm24, WTK4 et Rwt4 (réf. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15). D'autres gènes de résistance offrent une certaine variation à cette architecture avec des protéines kinases fusionnées à un domaine de transfert lipidique lié à une protéine régulatrice aiguë stéroïdogène (Yr36)16, un domaine C2 et une région multitransmembranaire (Pm4)17, une protéine majeure du sperme (Snn3)18, un NLR (Tsn1, Rpg5 et Sm1)19,20,21 et un domaine de facteur de von Willebrand de type A (Lr9)22.

Ces gènes de résistance codant pour la protéine de fusion kinase semblent être uniques aux Triticeae, le clade de graminées apparu il y a 12 millions d'années et qui englobe les céréales blé, seigle (Secale cereale) et orge (Hordeum vulgare)23. Cependant, les événements de fusion qui ont donné naissance à ces gènes, loin d'être rares et isolés, se sont produits à plusieurs reprises entre différentes classes de kinases et ont engendré diverses combinaisons10,12. Cette innovation génomique a entraîné une résistance contre des pathogènes fongiques phylogénétiquement distincts couvrant la division ascomycète/basidiomycète vieille d'environ 300 millions d'années.

Ici, nous avons cloné le gène de résistance à la rouille noire Sr43, qui a été transféré de l'agropyre élevé (Thinopyrum elongatum) au blé panifiable il y a 45 ans2,3. Le gène de résistance dominant Sr43 a été introgressé dans le chromosome 7D du blé hexaploïde (Fig. 1a, b). Nous avons mutagénisé les grains de la lignée d'introgression Sr43 avec du méthanesulfonate d'éthyle (EMS) et criblé 2 244 familles M2 survivantes pour leur sensibilité à Puccinia graminis f. sp. tritici (Pgt). Nous avons identifié 23 familles ségrégeant pour la sensibilité à la rouille de la tige, parmi lesquelles nous avons confirmé dix mutants indépendants par des tests de descendance (tableau supplémentaire 2) et un génotypage (figures supplémentaires 1 à 11).

un, Th. elongatum chromosome 7. b, Diagramme schématique du chromosome de translocation blé-Thinopyrum. c, mutations EMS identifiées le long du modèle de gène Sr43 prédit. d, diagramme schématique de Sr43, montrant les domaines prédits et les changements d'acides aminés induits par les mutations EMS. e, modèle tridimensionnel de Sr43, tel que prédit par AlphaFold. Vert, kinase; orange et bleu, domaines DUF ; lieurs flexibles jaunes. f, détail structurel (boîte en pointillés en e) d'un site de liaison à l'ATP de haute confiance (résidus rouges) dans DUF668 lié à une molécule d'ATP, tel que déterminé par le programme d'amarrage de petites molécules HADDOCK28. L'ATP est représenté par une structure en bâton (vert clair) reliée aux résidus DUF668 par des liaisons hydrogène (lignes rouges).

Pour cloner Sr43, nous avons effectué un tri des flux chromosomiques et séquencé le blé–Th. elongatum chromosome recombinant 7D dans la lignée parentale et huit mutants (données étendues Fig. 1 et tableaux supplémentaires 3 et 4). L'assemblage de la séquence de la lignée parentale et la cartographie des lectures mutantes ont identifié une fenêtre de 10 kilobases (kb) dans un échafaudage contenant une mutation dans les huit mutants. Pour déterminer la structure du gène du candidat Sr43, nous (1) avons effectué une analyse par séquençage profond du transcriptome (ARN-seq) des feuilles de semis Sr43 et cartographié les lectures sur l'échafaudage génomique Sr43 (Extended Data Fig. 2a) et (2) séquencé Sr43 clones obtenus par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir d'une banque d'ADN complémentaire pleine longueur. Nous avons détecté quatre variantes d'épissage différentes (données étendues Fig. 2b et tableaux supplémentaires 5 et 6). La variante d'épissage 1 contenait les huit mutations et consistait en 18 exons avec un cadre de lecture ouvert prévu de 2 598 paires de bases (pb) (Fig. 1c). Les huit mutations étaient toutes des transitions G/C à A/T typiques de la mutagenèse EMS et introduisaient des changements non synonymes (sept mutants) ou un codon d'arrêt précoce dans la séquence codante prédite (Fig. 1c, d et tableaux supplémentaires 7 et 8) . La probabilité que tous les mutants aient une mutation dans le même gène par hasard seul sur les 5 822 gènes non redondants du chromosome 7D (réf. 24) était de 4 × 10–6, indiquant que le gène identifié est un bon candidat pour Sr43 .

Comme toutes les mutations EMS identifiées affectaient le transcrit Sr43 prédominant de pleine longueur (Fig. 1c), nous avons utilisé sa séquence prédite de 866 acides aminés pour rechercher des domaines fonctionnels et des homologues. Nous avons déterminé que Sr43 héberge un domaine kinase N-terminal et deux domaines de fonction inconnue (DUF) dans son extrémité C (Fig. 1d). Cinq des mutations résidaient dans le domaine kinase, les trois mutations restantes affectant l'un ou l'autre DUF (Fig. 1d).

L'homologue BLAST le plus proche du domaine de la kinase Sr43 était la kinase associée au récepteur de l'interleukine-1 à sérine / thréonine kinase (STKc IRAK) (Fig. 12 supplémentaire), indiquant que Sr43 est probablement une kinase. D'autres recherches d'homologie ont suggéré que le domaine kinase est intact (Fig. 13 supplémentaire). À l'appui de cette observation, nous avons découvert qu'une protéine de fusion Sr43 marquée par affinité purifiée à partir d'Eschericia coli phosphorylait l'ADN gyrase de la protéine de liaison au maltose in vitro (Figures supplémentaires 14 à 16 et Tableau supplémentaire 9). De plus, le mutant 1013a a perturbé l'un des résidus de glycine conservés dans la boucle riche en glycine, ce qui suggère que l'activité kinase est requise pour la fonction de Sr43 (tableau supplémentaire 10). L'extrémité C-terminale de Sr43, contenant DUF3475 et DUF668, a une architecture de domaine similaire (44 % d'identité) à l'extrémité N-terminale des protéines PHYTOSULFOKINE SIMULATOR (PSI) d'Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), qui sont essentielles à la croissance des plantes25. Contrairement à Arabidopsis PSI1, Sr43 manquait d'un signal de localisation nucléaire putatif ou d'un site de myristoylation putatif. Sr43 n'avait pas de domaine transmembranaire, comme prédit par InterPro. Cependant, nous avons établi que Sr43 se localise probablement dans le noyau, le cytoplasme et les plastes, comme en témoigne la fluorescence détectée à partir de l'expression transitoire d'une construction Sr43-GFP (protéine fluorescente verte) dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana (Extended Data Fig. 3) . La localisation nucléaire et cytoplasmique a été confirmée dans des protoplastes de blé transfectés avec Sr43-GFP (Extended Data Fig. 3).

La structure du domaine de Sr43 était donc clairement différente de celle des protéines codées par les ~ 290 gènes de résistance végétale clonés, qui étaient en grande partie (73%) des récepteurs immunitaires extracellulaires ou intracellulaires (tableau supplémentaire 1). Pour explorer plus en détail la structure inhabituelle du Sr43, nous avons utilisé le système augmenté d'intelligence artificielle AlphaFold pour générer un modèle tridimensionnel (3D)26 (Données supplémentaires 1). Nous avons déterminé que Sr43 adopte une structure modulaire, avec la kinase et les deux DUF séparés par des boucles de liaison flexibles (Fig. 1e). Le domaine kinase contenait des hélices α et des brins β antiparallèles, tandis que les DUF étaient entièrement ⍺-hélicoïdaux. Nous avons comparé la structure prédite de la protéine Sr43 à celles de la Protein Data Bank27. Cela a identifié des similitudes structurelles entre DUF668 et certaines protéines de type protéine kinase de type récepteur en dehors de leurs domaines kinase. Nous avons recherché des sites de liaison à l'ATP à l'aide du programme d'amarrage de petites molécules HADDOCK28 et identifié un site de liaison à l'ATP de haute confiance dans DUF668 (Fig. 1f, tableau supplémentaire 11 et données supplémentaires 2).

Nous avons cloné un fragment génomique Sr43 de 14 kb comprenant 3,2 kb de séquence régulatrice en amont et 2,5 kb de séquence régulatrice en aval (Fig. 2a) (tableau supplémentaire 12) et introduit la construction binaire résultante dans le cultivar de blé Fielder. Nous avons obtenu une plante transgénique primaire (T0) et, sur la base d'une PCR quantitative (qPCR), avons identifié une lignée génétiquement stable avec environ deux copies de Sr43 (tableaux supplémentaires 13–14 et Fig. 17 supplémentaire). Nous avons testé des lignées homozygotes T1 et T2 contre un panel géographiquement et phénotypiquement diversifié de 11 isolats Pgt d'Amérique du Nord, du Moyen-Orient, d'Europe et d'Afrique. Dans dix cas, les lignées d'introgression transgéniques et de type sauvage Sr43 étaient résistantes, tandis que les cultivars Chinese Spring (le parent d'introgression) et Fielder étaient sensibles (Fig. 2b, Données étendues Fig. 4a, b et Tableau supplémentaire 15). En revanche, l'isolat Pgt 75ND717C était de virulence intermédiaire sur les lignées d'introgression et transgéniques Sr43 (Fig. 2b). Pour l'isolat Pgt 69MN399, nous avons comparé le phénotype à 21 ° C et 26 ° C et avons remarqué une réduction marquée de la résistance médiée par Sr43 à la température la plus élevée, conformément aux observations précédentes29 (Fig. 2c). Pris ensemble, ces résultats confirment (1) l'efficacité à large spectre de Sr43 (réf. 29), (2) qu'un fragment génomique de Sr43 de 14 kb est suffisant pour la fonction et (3) que la lignée transgénique récapitule fidèlement la spécificité de la race et la résistance sensible à la température du Sr43 de type sauvage.

a, Schéma de principe du fragment génomique Sr43 utilisé pour la transformation en blé cv. Joueur de terrain. b, Feuilles représentatives de semis de lignées de type sauvage et transgéniques Sr43 aux côtés de Fielder de type sauvage non transgénique et de témoins nuls inoculés avec P. graminis f. sp. tritici isolats 14GEO189-1 (avirulent sur Sr43) et 75ND717C (virulent intermédiaire sur Sr43). c, effet de la température sur la résistance médiée par Sr43 à l'isolat de Pgt 69MN399. Barre d'échelle, 1 cm.

Nous avons recherché des homologues de Sr43 pour étudier son origine évolutive. Nous avons identifié des protéines hébergeant soit le domaine kinase, soit les deux DUF seuls dans la famille des Poaceae couvrant 60 millions d'années d'évolution (tableaux supplémentaires 16 et 17 et données étendues, figures 5 et 6). Nous avons détecté l'arrangement du domaine de la protéine Sr43 uniquement dans les genres Thinopyrum, Triticum, Aegilops et Secale de la tribu Triticeae, mais pas dans Hordeum, ce qui suggère que Sr43 est probablement apparu il y a 6,7 à 11,6 millions d'années (Fig. 3 et Tableau supplémentaire 18). Dans les lignées dépourvues d'homologue clair de Sr43, nous avons cartographié les gènes codant pour la kinase et les DUF présents dans Sr43 sur différents chromosomes (par exemple, Sorghum bicolor, Zea mays, T. urartu et Ae. sharonensis) ou sur le même chromosome mais 6–36 mégabases (Mb) à part (Ae. tauschii et Setaria italica), suggérant que le recrutement du domaine kinase dans les DUF au locus Sr43 impliquait un événement de recombinaison ectopique (tableau supplémentaire 18). Chez Thinopyrum elongatum, l'état ancestral et Sr43 ont été retenus comme polymorphisme intraspécifique ; certaines espèces d'Aegilops et de Triticum ont conservé l'état ancestral (par exemple, Ae. tauschii), tandis que d'autres ont conservé l'innovation Sr43 (par exemple, les génomes T. aestivum et T. durum B) (Fig. 3).

L'âge du dernier ancêtre commun en millions d'années est indiqué à chaque nœud sur la base de la réf. 23. Le clade Triticeae est surligné en gris. Les espèces sont indiquées en bas et abrégées comme suit : Tel, Thinopyrum elongatum ; Asp, Ae. speltoides; TTB, Triticum turgidum ssp. génome durum B; TdB, génome de T. dicoccoides B ; TaB, génome de T. aestivum B; TtA, T. turgidum ssp. durum Un génome; TdA, T. dicoccoides A génome; TaA, T. aestivum Un génome ; Tu, T. neige ; Ou, Aegilops bicornis ; Ase, Ae. searsie ; Ou, Ae. longissima ; Frêne, Aegilops sharonensis; Chez, Ae. tauschii; TaD, génome de T. aestivum D ; Sc, échelle de céréales ; Hv, Hordeum vulgare ; As, avoine Sativa; Bd, Brachypodium détachement ; Os, Oryza sativa; Oui, Setaria italica; Sb, Sorgho bicolore ; Zm, maïs Zea. Le nombre de génomes analysés pour chaque espèce est indiqué entre parenthèses.

En résumé, nous avons cloné le gène de résistance à la rouille noire du blé Sr43, qui code pour une protéine kinase fusionnée à deux DUF. Sur les 82 gènes de résistance aux Triticeae clonés à ce jour, la plupart codent pour les NLR (n = 46), suivis des protéines de fusion protéine kinase (n = 15) (tableau supplémentaire 19). Parmi ces dernières, sept sont des kinases en tandem, tandis que Sr43, Pm4, Snn3, Sm1, Tsn1, Yr36, Rpg5 et Lr9 sont des protéines kinases simples ou en tandem fusionnées à différents domaines16,17,18,19,20,21,22 (Extended Data Fig. 7 et tableau supplémentaire 20). On sait peu de choses sur la fonction des protéines de fusion kinase, mais la plupart confèrent une résistance spécifique à la race qui est phénotypiquement indiscernable de la résistance médiée par NLR. Leurs gènes codants n'entrent pas dans la catégorie Lr34/Lr67 de résistance adulte, à large spectre et multipathogène30,31. Pour expliquer le rôle de ces kinases dans la résistance, nous avons cherché des indices auprès des NLR dont le modus operandi est maintenant bien compris. Les NLR peuvent agir comme des gardes qui surveillent les composants de l'hôte ciblés par les effecteurs pathogènes32. Ces gardes détectent l'interaction entre un effecteur et sa cible, conduisant à un changement conformationnel du NLR qui déclenche des réponses de défense en aval. Cette interaction tripartite crée un « bras de fer » évolutif qui impose une pression sélective (1) sur l'effecteur pour échapper à la détection par le NLR tout en maintenant sa capacité à contraindre la cible de pathogénicité, (2) sur le NLR pour reconnaître de nouvelles variantes d'effecteur et (3) sur la cible de pathogénicité pour éviter d'être perturbé par l'effecteur tout en maintenant sa fonction cellulaire. La duplication de la cible de pathogénicité peut la libérer de cette contrainte fonctionnelle et fournir un « leurre » à l'effecteur. Cette diversification peut également conduire à ce que le leurre se comporte génétiquement comme le gène de résistance33. Dans environ 10 % de tous les NLR, le leurre s'est intégré au NLR lui-même34. Une telle fusion gardien-leurre garantit que les deux composants sont hérités en tant qu'unité opérationnelle unique.

Par extrapolation, les protéines de fusion protéine kinase peuvent être des cibles de pathogénicité qui sont gardées par les NLR. Toutes les protéines de fusion de protéines kinases ont une kinase fonctionnelle apparente qui est fusionnée à un second domaine kinase, généralement non fonctionnel, mais parfois à un domaine totalement différent, comme par exemple Sr43, Lr9 et Pm4 (Extended Data Fig. 7). Peut-être que comme avec ces NLR qui portent un leurre intégré, ce deuxième domaine pourrait être un leurre intégré, tandis que la kinase fonctionnelle apparente exerce la fonction de signalisation. En effet, les plantes produisent diverses enzymes, notamment des protéines kinases avec différents domaines intégrés, pour catalyser les réactions de divers substrats. Dans le cas des protéines de résistance aux protéines kinases, le domaine intégré définirait les substrats spécifiques des protéines Avr pathogènes, tandis que la kinase catalyserait la phosphorylation de la protéine Avr, le domaine intégré, lui-même, ou un troisième partenaire de signalisation pour déclencher la défense en aval, éventuellement via une garde NLR (Extended Data Fig. 8a). La mutagenèse EMS de Yr15, Pm24, Sr62 et Sr43 a montré une prépondérance de mutations faux-sens affectant le site actif de la kinase ou la poche de liaison à l'ATP du domaine apparent de la kinase fonctionnelle (Extended Data Fig. 7), soutenant l'idée que la signalisation médiée par la kinase est requis pour la fonction. Alternativement, Sr43 (et par extrapolation d'autres protéines de résistance à la fusion de kinases)35,36 peut fonctionner sans partenaire de cosignalisation NLR (Extended Data Fig. 8b).

L'expression transgénique de Sr43 dans un contexte différent nous a permis de confirmer l'efficacité à large spectre de Sr43, soulignant sa valeur potentielle dans la sélection de résistance. Cependant, il est possible d'obtenir des mutants pathogènes à gain de virulence qui ont perdu la fonction AvrSr43 dans des conditions de laboratoire37. Par conséquent, Sr43 doit être utilisé en combinaison avec d'autres gènes de résistance à large spectre pour maximiser sa longévité sur le terrain.

Nous avons mutagénisé 2 700 graines de blé–Th. elongatum lignée d'introgression RWG34 contenant du Sr43 (réf. 29). Les graines sèches ont été incubées pendant 16 h avec 200 ml d'une solution EMS à 0,8 % (p/v) sous agitation constante sur un mélangeur à rouleaux (modèle SRT1, Stuart Scientific) pour assurer une exposition homogène maximale des graines à l'EMS. L'excès de solution a ensuite été éliminé et les graines ont été lavées trois fois avec 400 ml d'eau du robinet. Les graines M1 ont été cultivées en serre et les graines des familles M2 (têtes simples) ont été collectées. Huit graines par famille M2 ont été phénotypées avec l'isolat Pgt, race TPMKC. Les graines M3 dérivées de plantes M2 sensibles ont également été testées pour confirmer que les plantes sensibles M2 étaient de vrais mutants non ségrégeants. Pour exclure la contamination des semences, dix mutants ont été vérifiés à l'aide du génotypage par séquençage (GBS)38. Les données GBS de l'arrière-plan (Chinese Spring), des espèces donneuses (Th. elongatum, accession PI531737 de l'USDA-ARS GRIN), du Chinese Spring–Th. elongatum Sr43 introgression line (RWG34) et les lignées mutantes ont été cartographiées sur la séquence génomique de référence de Chinese Spring39 en utilisant BWA mem (v.0.7.12) avec des paramètres standard40. Les résultats du mappage ont été triés et convertis au format mpileup à l'aide de SAMtools41 (v.0.1.19). Les fichiers mpileup ont été examinés avec un script personnalisé précédemment publié lié à Zenodo42 pour calculer le pourcentage de polymorphismes mononucléotidiques du donneur qui ont été partagés avec la ligne d'introgression par intervalle donné. Plusieurs longueurs d'intervalle ont été testées ; un signal clair a été observé pour des intervalles de 10 Mb.

Des suspensions de chromosomes en métaphase mitotique ont été préparées à partir d'extrémités racinaires de la lignée d'introgression Sr43 et de huit mutants EMS comme décrit par la réf. 43 et réf. 44. En bref, les cellules du méristème de l'extrémité racinaire ont été synchronisées à l'aide d'hydroxyurée, accumulées en métaphase à l'aide d'amiprophos-méthyl et fixées dans du formaldéhyde à 2 % (v/v) à 5 °C pendant 20 min. Les chromosomes intacts ont été libérés par homogénéisation mécanique de 100 bouts de racine dans 600 µl de tampon LB01 glacé45. Des microsatellites GAA ont été marqués sur des chromosomes isolés par hybridation in situ fluorescente en suspension (FISHIS) à l'aide d'oligonucléotides 5'-FITC-GAA7-FITC-3' (Sigma) selon la réf. 46 et l'ADN chromosomique a été coloré avec 2 µg ml–1 de 4′,6-diamidino 2-phénylindole (DAPI). L'analyse et le tri des chromosomes ont été effectués à l'aide d'un cytomètre en flux et d'un trieur FACSAria II SORP (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Des caryotypes de flux bivariés traçant la fluorescence FITC et DAPI ont été acquis pour chaque échantillon et les chromosomes ont été triés à des taux de 20 à 40 particules par seconde. Deux lots de 55 000 et 70 000 copies du chromosome 7D avec le Th. Le segment de chromosome elongatum portant Sr43 a été trié à partir du Sr43-WT de type sauvage et un lot de 14 000 à 66 000 copies a été trié à partir des huit mutants dans des tubes PCR contenant 40 μl d'eau déminéralisée stérile (tableau supplémentaire 3).

Le contenu chromosomique des fractions triées en flux a été estimé par des observations au microscope de 1 500 à 2 000 chromosomes triés dans une goutte de 10 μl de tampon PRINS contenant 2,5 % (p/v) de saccharose47 sur une lame de microscope. Les chromosomes séchés à l'air ont été marqués par FISH avec des sondes pour la répétition pSc119.2, la répétition de la famille Afa et l'ADN ribosomal 45S qui ont permis l'identification de tous les blés et Th. chromosomes elongatum selon la réf. 48. Pour déterminer le contenu et la pureté des chromosomes dans les fractions triées, au moins 100 chromosomes dans chaque échantillon trié en flux ont été classés selon le caryotype décrit par la réf. 49.

Les deux échantillons chromosomiques séparément triés en flux des génotypes de type sauvage ont été utilisés pour la préparation de deux bibliothèques de séquençage. Les échantillons chromosomiques ont été traités avec de la protéinase K (60 ng μl-1), après quoi l'ADN a été purifié sans amplification. Les échantillons chromosomiques triés à partir des mutants ont été traités de la même manière, mais leur contenu en ADN a été amplifié à 2, 5–12, 6 μg par amplification par déplacement multiple (tableau supplémentaire 3) à l'aide d'un kit d'amplification d'ADN Illustra GenomiPhi v.2 (GE Healthcare) comme décrit par la réf. 50 et séquencé par Novogene. Pour les génotypes de type sauvage Sr43, 20 ng d'ADN non amplifié ont été fragmentés dans un volume de 20 μl à l'aide d'un Bioruptor Plus (Diagenode) cinq fois pendant 30 s sur le réglage HIGH. Les bibliothèques pour le séquençage ont été préparées à partir d'ADN fragmenté à l'aide d'un kit de préparation de bibliothèque d'ADN NEBNext Ultra II pour Illumina avec les modifications suivantes : (1) la sélection de la taille a été dirigée pour une taille de bibliothèque finale plus grande (~ 1 000 pb) et (2) l'enrichissement par PCR a été effectué avec six cycles de PCR. Les bibliothèques ont été séquencées sur une plate-forme HiSeq2500 à l'aide d'un kit HiSeq Rapid SBS v.2 sous forme de lectures appariées de 250 pb. Les données brutes ont été découpées pour les bases de faible qualité à l'aide de Trimmomatic51 et assemblées en échafaudages avec Meraculous52 (v.2.0.5) à l'aide de k-mers de 111 nucléotides. Les échafaudages plus courts que 1 kb ont été éliminés. L'assemblage contenait 168 523 échafaudages avec une longueur totale d'assemblage de 1,29 gigabase (Gb). Parmi eux, 25 581 échafaudages avaient une longueur supérieure à 13,9 kb avec une longueur totale de 631,8 Mb.

Huit mutants sensibles issus de familles M2 indépendantes ont été sélectionnés pour la cartographie MutChromSeq53. Les lectures brutes des huit mutants ont été cartographiées individuellement sur les fragments d'échafaudage hachés de 10 kb à l'aide de BWA40 (v.0.7.12) et SAMtools41 (v.1.8). Un fragment a été identifié comme ayant une seule mutation nucléotidique chez tous les mutants. Nous avons calculé la probabilité qu'il s'agisse du gène candidat en utilisant la formule numéro 4 développée par la réf. 12, avec 2 598 pb de séquence codante Sr43 (CDS), en supposant que le gène CDS moyen a une longueur de 1 000 pb et que le chromosome 7D a 5 822 gènes. Toutes les mutations identifiées étaient des mutations de transition G vers A ou C vers T, qui sont typiques de la mutagenèse EMS.

L'ARN total a été extrait du Chinese Spring–Th. elongatum Sr43 lignée d'introgression avec un RNeasy Plant Mini Kit (référence catalogue/ID 74904, Qiagen) suivant le protocole du fabricant et digéré avec Dnase I (Roche). L'ARN-seq a été réalisé par Novogene. Les lectures d'ARN-seq ont été coupées avec Trimmomatic (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic). Hisat2 (v.2.1.0)54 a été utilisé pour cartographier les lectures courtes sur la séquence génomique Sr43. Le fichier de sortie SAM a été converti en un fichier BAM à l'aide de SAMtools41 (v.1.8) (http://www.htslib.org/) et trié en fonction de leur position le long de la séquence génomique Sr43 et indexé pour la visualisation par IGV (https:/ /software.broadinstitute.org/software/igv/). Pour déterminer l'épissage alternatif de Sr43, nous avons construit une bibliothèque d'ADNc pleine longueur à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc PCR SMARTer (n° de catalogue 634926, Clontech/TaKaRa). Les transcrits correspondant à chacun des quatre variants d'épissage ont été identifiés par séquençage Sanger de 20 clones obtenus à partir de la transformation de la PCR longue portée sur la banque d'ADNc pleine longueur avec des amorces spécifiques aux extrémités 5 'et 3' de Sr43 (tableau supplémentaire 5).

Sur la base de l'annotation du gène, trois segments se chevauchant du gène Sr43 ont été amplifiés par PCR (tableau supplémentaire 12) avec de l'ADN polymérase Q5 haute fidélité (NEB) conformément aux instructions du fabricant. Les produits de PCR ont été purifiés avec un kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN) et en queue A à l'aide de l'ADN polymérase Taq avant d'être clonés dans le vecteur pCR2.1 (TOPO PCR Cloning Kits-K202020, Thermo Fisher Scientific). Les clones positifs ont été digérés avec trois ensembles d'enzymes de restriction, NotI, NotI-PvuI et PvuI-PmeI (NEB), pour générer les parties 1, 2 et 3 du fragment Sr43, respectivement. Les fragments digérés ont été purifiés sur gel puis les parties 2 et 3 ont été combinées dans une réaction de ligation à trois voies avec le vecteur binaire pGGG-AH-NotI/PmeI12 digéré avec NotI et PmeI, en utilisant l'ADN ligase T4 (M0202S, NEB). Ensuite, la construction binaire a été linéarisée avec NotI et la partie 1 a été ajoutée. Un clone positif avec la partie 1 dans l'orientation correcte, pGGG-Sr43, a été vérifié par séquençage Sanger. Le pGGG-Sr43 est disponible auprès d'Addgene sous le numéro d'accession 186974.

La construction binaire pGGG-Sr43 a été transformée en blé cv. Fielder utilisant la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens55. Le nombre de copies Sr43 a été postulé en testant le nombre de copies du marqueur sélectionnable hygromycine B phosphotransférase dans les plantes T0 et T1 par iDNA Genetics en utilisant qPCR56. À partir d'une famille T1 génétiquement stable sans ségrégation, nous avons avancé une lignée T2 (BW_30183) pour un test supplémentaire du nombre de copies. Nous avons conçu des amorces spécifiques au gène pour Sr43, le gène marqueur sélectionnable de l'hygromycine B phosphotransférase et les gènes de contrôle endogènes du blé à copie unique, à trois et à six copies (tableau supplémentaire 13). Les séquences d'amorce pour les gènes endogènes ont été conçues sur la base du cv. Génome de référence de Fielder57. L'ADN a été extrait d'une seule plante T3 (dérivée de la famille T2 BW_30183) à l'aide du kit d'extraction d'ADN génomique Qiagen (Qiagen, n° de catalogue 19060) avec des colonnes de 500 par g (Qiagen, lot 169047970) conformément au QIAGEN Genomic DNA Handbook. La qPCR a été réalisée dans une réaction de 10 μl avec 1X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad), amorce 0,5 μM et 2 ng μl-1 d'ADN en utilisant une dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie d'une dénaturation à 95 ° C pendant 15 s et recuit + extension à 60 °C pendant 30 s, pendant 40 cycles sur un système de PCR en temps réel CFX96. Le nombre de copies du gène Sr43 a été calculé sur la base des gènes de référence endogènes (Fig. 17 supplémentaire et Tableau supplémentaire 14).

Les tests de rouille de la tige ont été effectués en serre ou en chambre de culture. Les serres/chambres de croissance ont été maintenues à 21 °C avec une période de lumière de 14 h et une humidité relative d'environ 40 %. Les plantes ont été inoculées avec P. graminis f. sp. tritici lorsque la deuxième feuille était complètement déployée, 10–12 jours après le semis, à raison d'environ 0,12 mg de spores par plante. Après une période d'incubation de 16 h dans l'obscurité dans des conditions d'humidité élevée (100 %), les semis inoculés ont été remis dans la serre/chambre de croissance, puis notés pour leur réaction à la rouille de la tige 12 à 14 jours plus tard. Les types d'infection ont été enregistrés à l'aide de l'échelle de Stakman58. Pour les tests de sensibilité à la température, la température élevée a été fixée à 26 °C. Les races Pgt utilisées dans cette étude étaient TPMKC (isolat 74MN1409) des États-Unis ; QTHJC (isolats 75ND717C et 69MN399) des États-Unis ; TKTTF (isolat ET11a-18) d'Éthiopie ; TTKTT (isolat KE184a/18) du Kenya ; TKTSC (isolat IS n° 2079), TTTTF (isolat IS n° 2127) et TTTTC (isolat IS n° 2135) d'Israël ; TKTTF (isolat FR68-20) de France ; TTRTF (isolat IT16a-18) d'Italie ; TKTTF (isolat UK-01) du Royaume-Uni ; et TRTTF (isolat 14GEO189-1) de Géorgie (tableau supplémentaire 15).

Nous avons utilisé InterPro v.88.0 pour rechercher des domaines de famille de protéines dans Sr43, par exemple, un domaine transmembranaire59. Pour vérifier la présence de sites de myristoylation et de signaux de localisation nucléaire, nous avons utilisé respectivement Myristoylator60 et cNLS mapper61 (consulté le 11 mars 2023).

Nous avons utilisé le code source ouvert d'AlphaFold v.2.0 (réf. 26) et le supercalculateur de l'Université des sciences et technologies du roi Abdallah, Shaheen II (https://www.hpc.kaust.edu.sa/) via le système multinœud Bouquetin (https://www.hpc.kaust.edu.sa/ibex). Nous avons entré la séquence d'acides aminés de Sr43 et la sortie était de cinq modèles non relaxés, cinq relaxés et cinq classés au format .pdb. Nous avons utilisé le modèle ranking_1.pdb qui contient les prédictions avec la plus grande confiance avec le meilleur score de test de différence de distance locale (lDDT) de 70,76. Nous entrons ensuite le modèle ranking_1.pdb obtenu à partir d'Alphafold et de chaque domaine séparément dans le serveur de comparaison de structure protéique Dali27.

Nous avons utilisé HADDOCK2.4, un serveur Web pour le criblage de sites de liaison de petites molécules28, pour cribler le domaine DUF2 à la recherche de sites potentiels de liaison à l'ATP. Les fichiers d'entrée se composaient du domaine DUF2 de Sr43 après suppression de toutes les boucles du fichier .pdb et de l'ATP au format .pdb. Les paramètres utilisés étaient :

Définir des contraintes d'interaction aléatoirement ambiguës à partir de résidus accessibles—ON

Nombre de structures pour l'accostage à corps rigide — 10 000

Nombre de structures pour le raffinement semi-flexible—400

Nombre de structures pour le raffinement final—400

Méthode de regroupement (RMSD ou fraction de contacts communs (FCC))—RMSD

Coupure RMSD pour le clustering (recommandé : 7,5 A pour RMSD, 0,60 pour FCC)—2,0

Evdw 1—1.0

Eélec 3—0,1

Température initiale pour la deuxième étape de refroidissement TAD avec chaîne latérale flexible à l'interface - 500

Température initiale pour la troisième étape de refroidissement TAD avec une interface entièrement flexible—300

Nombre d'étapes MD pour corps rigide haute température TAD—0

Nombre d'étapes MD pendant la première étape de refroidissement du corps rigide—0

Les fichiers de sortie étaient dix groupes de différents sites de liaison à l'ATP prédits. Le cluster avec le meilleur score de prédiction (Z-score) était le cluster 6.

Le CDS natif de Sr43 plus deux nucléotides supplémentaires (CC) au début du CDS (pour maintenir le cadre de lecture ouvert avec l'étiquette His6) a été synthétisé commercialement (Twist Bioscience) et cloné dans le vecteur d'entrée Gateway pTwist_ENTR. Pour l'expression de la protéine recombinante, Sr43 a été transféré dans le vecteur d'expression pDEST-His6-MBP par la réaction Gateway LR clonase (Invitrogen). Le clone résultant a été vérifié par séquençage Sanger.

La protéine marquée His6-MBP-Sr43 a été exprimée dans la souche E. coli Rosetta en développant la culture bactérienne à une densité optique OD600 de 0,8 à 37 ° C, puis en induisant l'expression de la protéine par addition de 0, 5 mM d'isopropyl β-d-thiogalactopyranoside à 18 ° C et en incubant davantage la culture pendant 14 à 16 h. La protéine recombinante a été purifiée dans des conditions natives en utilisant des billes d'agarose Ni-NTA (n° de catalogue Invitrogen R901-15) en suivant les instructions du fabricant.

La composition du tampon de la protéine His6-MBP-Sr43 purifiée a été remplacée par le tampon de réaction kinase (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 1 mM DTT et 50 μM ATP) à l'aide de colonnes de dessalement PD10 (GE Soins de santé). His6-MBP-Sr43 a été mélangé avec un ADN gyrase de protéine de liaison au maltose substrat commercial (Prospec Protein Specialists PRO-616) et incubé à température ambiante pendant 30 min. Après avoir ajouté du tampon SDS-échantillon pour arrêter la réaction, la protéine a été dénaturée par ébullition à 95 ° C pendant 10 min. L'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide a été utilisée pour résoudre les échantillons de protéines. Le gel a été coloré avec SimplyBlue SafeStain (Novex cat. no. LC6065) et la bande qui correspondait à la protéine d'intérêt a été excisée, coupée en morceaux de 0,5 mm3 et décolorée avec quatre lavages séquentiels de 15 min chacun avec de l'acétonitrile et 100 mM NH4HCO3 . Les protéines dans les morceaux de gel ont été réduites avec du chlorhydrate de phosphine Tris (2-carboxyéthyl) 10 mM (TCEP, C-4706 Sigma) dans du NH4HCO3 100 mM à 37 ° C pendant 1 h. Ensuite, les liaisons disulfure réduites ont été alkylées avec 50 mM d'iodoacétamide à température ambiante pendant 30 min. Après réduction et alkylation des protéines, elles ont été digérées avec de la trypsine (trypsine porcine, Promega) à 37°C pendant une nuit. De l'acide formique a été ajouté à une concentration finale de 1 % pour arrêter la digestion et les peptides trypsiques ont été récupérés en incubant les morceaux de gel dans de l'acétonitrile. Les peptides récupérés ont été dessalés à l'aide d'une cartouche sous vide Sep-Pak C18 de 1 ml (Waters SKU : WAT023590) et analysés par chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) (Fig. 14 supplémentaire). Les échantillons de peptides ont été séparés à l'aide d'une colonne C18 reliée à un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos (Acclaim PepMap C18, longueur de 25 cm, taille de particule de 75 m ID 3 m, porosité 100, Dionex). Le gradient LC est passé de 5 % de solvant B (eau/ACN/acide formique, 20/80/0,1, v/v/v) à 45 % de solvant B en 45 min, puis à 90 % de solvant B pendant 10 min. En utilisant la fragmentation HCD dans l'instrument Orbitrap Fusion Lumos, l'instrument MS a enregistré des spectres de fragmentation sur les dix meilleurs peptides. À l'aide de l'interface msConvert, les fichiers de données RAW ont été convertis en fichiers MGF. Le serveur Mascot a été utilisé pour effectuer des recherches dans la base de données et les critères suivants ont été utilisés : (1) base de données contenant les séquences d'acides aminés de Sr43, de MBP et de protéines contaminantes ; (2) spécificité enzymatique (la trypsine permettant deux clivages manqués autorisés) ; (3) les résidus cystéine sont modifiés de manière fixe (carbamidométhyle); (4) la phosphorylation des résidus S, T et Y peut être modifiée de manière variable ; (5) les masses de précurseurs sont tolérables jusqu'à 5 ppm ; (5) les ions fragments sont tolérables jusqu'à 0,02 Da. Les scores Mascot et MD ont été utilisés pour filtrer les résultats. Les peptides identifiés pour déterminer la couverture protéique de la protéine de liaison au maltose sont présentés lorsqu'ils sont incubés seuls et lorsqu'ils sont incubés avec His6-MBP-Sr43 (Figs. 15 et 16 supplémentaires).

Pour générer la construction 35S: Sr43-GFP, un cadre de lecture ouvert optimisé en codons de la version 1 de l'épissage Sr43 a été synthétisé et ligaturé dans pDONR221 (Twist Bioscience). Le clone d'entrée a ensuite été introduit dans le vecteur binaire pB7FGW2,0 par simple réaction Gateway LR (Invitrogen). La construction 35S:PLSP2A-mRFP a été générée en combinant un clone d'entrée du CDS PLSP2A avec le promoteur p35S et le rapporteur fluorescent mRFP à l'aide d'un clonage séquentiel Gateway.

Les constructions 35S:Sr43-GFP et 35S:PLSP2A-mRFP ont été transférées dans la souche GV3101 d'A. tumefaciens et infiltrées dans des feuilles de tabac comme décrit dans la réf. 62. Le signal GFP a été excité à 488 nm et détecté entre 500 et 535 nm. Le signal mRFP a été excité à 555 nm et détecté entre 566 et 646 nm. Les images ont été acquises à l'aide d'un Leica SP8 Stellaris FALCON inversé avec un objectif HC PL APO 63 × 1,2 W CORR UVIS CS2.

Pour générer la construction pZmUbi:GFP-Sr43, la version d'épissage 1 Sr43 CDS a été sous-clonée du pDONR221 mentionné ci-dessus dans le vecteur pJET1.2 (Thermo Fisher) en tant que module de niveau I pour un clonage supplémentaire du Golden Gate63. La construction d'expression de niveau II a été assemblée avec le squelette de niveau II (BB10), le promoteur ZmUbiquitine de niveau I, le marqueur GFP de niveau I, le niveau I Sr43 et le terminateur NOS de niveau I via une réaction de ligature de coupure BsaI63. La construction pZmUbi:NLS-mCherry a été générée de la même manière en combinant le squelette de niveau II, le promoteur ZmUbqiuitin de niveau I, la séquence de localisation nucléaire de niveau I, le mCherry de niveau I et le terminateur NOS de niveau I. Le contrôle pZmUbi:GFP a été généré en transférant le CDS GFP via la réaction de clonase LR à pZmUbi:GW64.

Les ADN plasmidiques ont été purifiés à partir d'E. coli hébergeant pZmUbi:GFP-Sr43, pZmUbi:NLS-mCherry, pZmUbi:GFP avec le kit NucleoBond Xtra Maxi Plus (Macherey-Nagel). Des cellules de mésophylle ont été isolées à partir de semis de blé âgés de 9 jours (cv. Fielder) cultivés dans des conditions de jours courts (8 h de lumière, 16 h d'obscurité). L'isolement et la transfection des protoplastes ont été réalisés comme décrit dans la réf. 64.

La fluorescence a été observée avec un microscope confocal droit Carl Zeiss LSM 880 Axio Imager 2 avec un objectif Plan-Apochromat 63 × / 1,4 Oil DIC M27. La GFP a été excitée à l'aide d'un laser à argon (488 nm) et détectée entre 494 et 552 nm. Le mCherry a été excité à l'aide d'un laser à semi-conducteurs pompé par diode (561 nm) et la fluorescence a été détectée entre 596 et 649 nm.

Nous avons construit un arbre phylogénétique sur la base des séquences protéiques alignées de 100 meilleurs résultats (ID ≥ 75 %) de la séquence du domaine kinase et de la séquence de la région Sr43 DUF par rapport à la base de données de protéines NCBI. L'arbre phylogénétique (méthode de jonction de voisins) pour les domaines kinase et DUF a été calculé avec Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) et dessiné avec iTOL (https://itol. embl.de/).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés dans l'étude actuelle sont accessibles au public comme suit. Les lectures de séquences ont été déposées dans l'European Nucleotide Archive sous les numéros de projet PRJEB52878 (données GBS), PRJEB51958 (données triées par flux de chromosomes) et PRJEB52088 (données ARN-seq). Le gène Sr43 et la séquence du transcrit ont été déposés dans NCBI Genbank sous le numéro d'accession ON237711. L'assemblage du chromosome Sr43 a été déposé à Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.6777941). Les bases de données/ensembles de données publics suivants ont été utilisés dans l'étude : Chinese Spring reference genome39, Gramene (http://www.gramene.org/), https://ensembl.gramene.org/Multi/Tools/Blast, https:/ /wheat.pw.usda.gov/GG3/blast, Séquence protéique non redondante BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome), Navigateur de taxonomie ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=1437183), AlphaFold26 (https://alphafold.ebi.ac.uk), Dali27 (http://ekhidna2. biocenter.helsinki.fi/dali/) et HADDOCK28 (https://www.bonvinlab.org/education/HADDOCK-binding-sites/.

Les scripts utilisés dans ces analyses ont été publiés sur GitHub (https://github.com/steuernb/GBS_introgression_line_analysis) et liés à Zenodo (https://zenodo.org/badge/latestdoi/394326594)42.

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Nous remercions Y. Wang pour son aide dans le phénotypage et la compilation du tableau supplémentaire 19 ; ES Vande Loo pour la préparation des médias ; H. Zhang et AW Weatherhead pour leur aide en spectrométrie de masse (tous KAUST, Arabie Saoudite) ; Y. Jin (USDA-ARS, Minnesota, USA) pour l'utilisation des isolats Pgt 74MN1409, 75ND717C, 69MN399 et 14GEO189-1 ; M. van Slageren (Kew, Royaume-Uni) pour son aide dans la nomenclature des espèces ; S. Saile et L. Rohr (Université de Tübingen, Allemagne) pour les modules pZmUbi et NLS Golden Gate ; Z. Dubská, R. Šperková et J. Weiserová pour la préparation d'échantillons de chromosomes pour la cytométrie en flux ; et M. Said et P. Cápál pour le tri des chromosomes (tous IEB, République tchèque). Cette recherche a été soutenue par le groupe NBI Research Computing et la plate-forme informatique du John Innes Centre, Royaume-Uni, et financée par un financement de la Fondation 2Blades, États-Unis, à BJS et BBHW ; le Conseil de recherche en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC) Designing Future Wheat Cross-Institut Strategic Program to BBHW (BBS/E/J/000PR9780) ; Bourse de recherche Marie Curie 'AEGILWHEAT' (H2020-MSCA-IF-2016-746253) et l'Office national hongrois de la recherche, du développement et de l'innovation (K135057) à IM ; Projet FEDER "Les plantes comme outil pour un développement mondial durable" (n° CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827) à JB, KH, MK et JD ; Université des sciences et technologies du roi Abdallah à BBHW, Ł.J., IB et HH ; la dotation Lieberman-Okinow de l'Université du Minnesota à BJS; la Fondation Daimler et Benz, par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) CEPLAS (EXC 2048/1—Project-ID : 390686111) et le programme DFG Emmy Noether (SA 4093/1-1) à IMLS ; la Fondation Gordon et Betty Moore par le biais de la subvention GBMF4725 à la Fondation 2Blades et JDGJ ; et la Gatsby Charitable Foundation à JDGJ

T. Lynne Reuber

Adresse actuelle : Enko Chem, Mystic, CT, USA

István Molnár

Adresse actuelle : Centre de recherche agricole, ELKH, Institut agricole, Martonvásár, Hongrie

Programme de sciences végétales, Division des sciences et de l'ingénierie biologiques et environnementales (BESE), Université des sciences et technologies du roi Abdallah (KAUST), Thuwal, Arabie saoudite

Guotai Yu, Naganand Rayapuram, Fatimah R. Aljedaani, Catherine Gardener, Jesse Poland, Heribert Hirt, Ikram Blilou & Brande BH Wulff

Centre pour l'agriculture du désert, KAUST, Thuwal, Arabie saoudite

Guotai Yu, Naganand Rayapuram, Fatimah R. Aljedaani, Catherine Gardener, Jesse Poland, Heribert Hirt, Ikram Blilou & Brande BH Wulff

Centre John Innes, Norwich Research Park, Norwich, Royaume-Uni

Guotai Yu, Catherine Gardener, Yajuan Yue, Ngonidzashe Kangara, Burkhard Steuernagel, Sadiye Hayta, Mark Smedley, Wendy Harwood et Brande BH Wulff

Département de pathologie végétale, Université du Minnesota, St. Paul, MN, États-Unis

Oadi Matny, Ryan Johnson, Matthew N. Rouse et Brian J. Steffenson

Programme de biosciences, Smart Health Initiative, BESE, KAUST, Thuwal, Arabie saoudite

Spyridon Gourdoupis & Lukasz Jaremko

Département de biochimie végétale, Centre de biologie moléculaire végétale (ZMBP), Université de Tübingen, Tübingen, Allemagne

Yan L. Wang & Thorsten Nürnberger

Institut des sciences végétales, Université de Cologne, Cologne, Allemagne

Emma E. Crean & Isabel M.-L. Saur

Pôle d'excellence en sciences végétales (CEPLAS), Cologne, Allemagne

Isabelle M.-L. Saur

Département d'agroécologie, Université d'Aarhus, Slagelse, Danemark

Mehran Patpour

Département de pathologie végétale, Kansas State University, Manhattan, KS, États-Unis

Shuangye Wu & Jesse Pologne

Le laboratoire Sainsbury, Université d'East Anglia, Norwich, Royaume-Uni

Jonathan DG Jones

Fondation 2Blades, Evanston, Illinois, États-Unis

T. Lynne Reuber

Institut de recherche sur les cultures céréalières, Université de Tel Aviv, Tel Aviv, Israël

Moshé Ronen

Institut de recherche sur les cultures céréalières et École des sciences végétales et de la sécurité alimentaire, Université de Tel Aviv, Tel Aviv, Israël

Amir Sharon

USDA-ARS, Cereal Disease Laboratory, St. Paul, MN, États-Unis

Matthieu N. Rouse

Unité de recherche sur l'amélioration des cultures et la génétique, USDA-ARS, Western Regional Research Center, Albany, Californie, États-Unis

Steven Xu

Centre de la région Haná pour la recherche biotechnologique et agricole, Institut de botanique expérimentale de l'Académie tchèque des sciences, Olomouc, République tchèque

Kateřina Holušová, Jan Bartoš, István Molnár, Miroslava Karafiátová & Jaroslav Doležel

Centre de recherche de la mer Rouge, BESE, KAUST, Thuwal, Arabie saoudite

Lukasz Jaremko

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GY a généré la population mutante. Mutants RJ, BJS et NK criblés et vérifiés. Mutants génotypés BS, SW et JP. IM, MK et JD ont effectué le tri et l'amplification des flux chromosomiques. GY, KH et JB ont fait l'assemblage des chromosomes. GY a effectué des analyses bioinformatiques pour identifier le Sr43. GY a extrait l'ARN et déterminé la structure du gène Sr43 et l'épissage alternatif. GY, SG et L.J. annoté Sr43. SG et L.J. effectué des analyses de modélisation 3D. MS a développé le vecteur binaire. GY a conçu la construction Sr43. SH et WH ont transformé Sr43 en blé. GY, OM, MP et MNR ont phénotypé les lignées transgéniques. FRA et IB (chez N. benthamiana) et YLW, EEC, TN et IM-LS (chez le blé) ont déterminé la localisation de Sr43. NR et HH ont effectué un test de kinase. GY a effectué la phylogénétique et la synténie. OM, SX, MRN, MR, AS, JDGJ, CG, YY et TLR ont fourni du matériel génétique, des cultures de rouille ou un soutien et des conseils scientifiques. BBHW, GY et BJS ont conçu l'étude. GY et BBHW ont rédigé le manuscrit. Tous les coauteurs ont lu et approuvé le manuscrit final. Les auteurs sont regroupés par institution dans la liste des auteurs, à l'exception des six premiers et des six derniers auteurs.

Correspondance à Brian J. Steffenson ou Brande BH Wulff.

GY et BBHW sont les inventeurs de la demande de brevet provisoire US 63/250 413 déposée par 2Blades et relative à l'utilisation de Sr43 pour la résistance à la rouille de la tige chez le blé transgénique. TLR a été employé par la Fondation 2Blades, qui a cofinancé les travaux. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Genetics remercie Tzion Fahima, Zhiyong Liu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Le diagramme de points DAPI (axe x) vs FITC (axe y) a été obtenu après l'analyse de suspensions de chromosomes colorées au DAPI marquées par FISHIS avec des sondes conjuguées au FITC pour les microsatellites GAA et ACG. Les chromosomes de translocation 7D/7el2 ont été triés à partir de la fenêtre de tri représentée par un rectangle rouge à des puretés de 60 à 65 %. Encart : chromosome de translocation 7D/7el2 après FISH avec des sondes pour la répétition pSc119.2 (vert), la répétition de la famille Afa (rouge) et l'ADNr 45S (jaune) qui a été utilisé pour identifier les chromosomes dans la fraction triée. Les chromosomes ont été contre-colorés par DAPI (bleu).

a, Cartographie des lectures d'ARN-seq du transcriptome de la feuille sur le locus Sr43. b, variants d'épissage d'ARNm identifiés par séquençage de clones d'ADNc pleine longueur. Les introns et les exons sont représentés respectivement par des lignes et des cases. Les variants d'épissage 1, 2, 3 et 4 ont respectivement 8, 7, 5 et 6 mutations induites par EMS dans la séquence codante.

a, expression transitoire médiée par Agrobacterium d'une construction de fusion Sr43-GFP ou d'une construction GFP pilotée par le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) dans Nicotiana benthamiana. La fluorescence GFP dans les cellules épidermiques a été enregistrée 3 jours après l'infiltration par microscopie confocale à balayage laser. b, expression transitoire médiée par Agrobacterium de la 35S:Sr43-GFP avec une construction de marqueur de plaste 35S:PLSP2A-RFP dans N. benthamiana. La fluorescence GFP ou RFP dans les cellules épidermiques a été enregistrée 3 jours après l'infiltration par microscopie confocale à balayage laser. c, expression transitoire d'une construction de fusion ZmUbi:GFP-Sr43 avec un marqueur nucléaire ZmUbi:NLS-mCherry dans des cellules de mésophylle de blé (panneau supérieur) et un ZmUbi:GFP comme contrôle (panneau inférieur). La fluorescence GFP et mCherry a été enregistrée 16 à 20 heures après la transfection par microscopie confocale à balayage laser. Une cellule non transformée est indiquée par une flèche noire. La barre d'échelle dans toutes les images est de 20 µm. Les noyaux (N), le cytoplasme (C) et les plastes (P) sont indiqués sur les images par des flèches blanches. Les tailles des protéines de fusion GFP et Sr43-GFP sont estimées à 27 et 126 kDa, respectivement. Les expériences ont été répétées dans cinq (Sr43-GFP, panneau a), deux (GFP, panneau b), trois (panneau b), cinq (GFP-Sr43) et deux (GFP) expériences indépendantes, respectivement, avec des résultats similaires. Dans les expériences sur N. benthamiana, nous avons infiltré deux feuilles et criblé plus de 100 noyaux par feuille.

a, lignées transgéniques homozygotes de la génération T1 aux côtés du cultivar parent non transgénique Fielder. b, Lignées transgéniques homozygotes et ségrégants nuls de la génération T2. Barre d'échelle, 1 cm.

Un seuil minimum de couverture de 94 % et une identité ≥ 60 % ont été appliqués. ATSS, Aegilops tauschii subsp. étranglé HVSV, Hordeum vulgare subsp. vulgaire; LR, Lolium rigidus; OS, riz sativa ; PV, Panicum virgatum ; SI, Setaria italien; TA, blé d'été ; TD, Triticum dicoccoides; TTSD, Triticum turgidum subsp. dur ZM, Zea mays.

Un seuil minimum de couverture ≥ 99 % et une identité de ≥ 70 % ont été appliqués. ATSS, Aegilops tauschii subsp. étranglé BD, Brachypodium distachyon ; DE, Exile Digitaria ; CE, Eragrostus curvula ; HV, Bardeum vulgare ; HVSV, Hordeum vulgare subsp. vulgaire; LR, Lolium rigidus; ML, Miscanthus lutarioriparius; OB, Oryza brachyantha; OMVG, Oryza meyeriana var. granulé OS, riz sativa ; OSIG, Groupe indien du riz ; OSJG, Groupe Riz Sativa Japonica ; PH, Panicum hallii; PHVH, Panicum hallii var. de la salle ; MP, Panicum miliaceum ; PV, Panicum virgatum ; SI, Setaria italien; SV, Setaria verdi; SB, Sorgho bicolore ; TA, blé d'été ; TD, Triticum dicoccoides; TTSD, Triticum turgidum subsp. dur Toi, le blé dans la chaleur; ZM, Zea mays; ZP, mauvaises herbes des marais.

Les sites de liaison à l'ATP et actifs des kinases sont indiqués par des cases et des cercles dans les kinases actives et pseudo, respectivement, comme déterminé par balayage Interpro, recherche d'homologie dans des modèles 3D dérivés d'AlphaFold et/ou BLAST. Les barres blanches indiquent les mutations faux-sens de perte de fonction obtenues à partir des écrans de mutants EMS. Huit mutations dans les domaines de liaison ne sont pas représentées. Les protéines sont organisées de haut en bas par date de publication : Rpg1, Yr36, Tsn1, Rpg5, Yr15, Sr60, Pm24, Sm1, Snn3, Pm4 (encodées par splice version 2), WTK4, Rwt4, Sr62 (refs. 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21), Sr43 (cette étude) et Lr9 (réf. 22). START, transfert lipidique lié aux protéines de régulation aiguë stéroïdogène ; NLR, liaison aux nucléotides et répétition riche en leucine ; MSP, protéine majeure du sperme ; C2, domaine C2 ; PRT C, domaine C-terminal de la phosphoribosyl transférase; DUF, domaine de fonction inconnue ; vWA, facteur de von Willebrand domaine de type A. Les barres blanches indiquent la position des mutations de perte de fonction dérivées de l'EMS (à l'exclusion des mutations précoces des codons d'arrêt) lorsqu'elles sont disponibles. Le nombre 9 sous le site actif dans la kinase active de Lr9 indique la présence de neuf mutations.

La protéine de fusion protéine kinase (PK) contient un leurre intégré (ID) qui piège la protéine effectrice d'avirulence (carré rouge). Cela déclenche une autophosphorylation de la protéine kinase ou du leurre, de l'effecteur ou de la garde de répétition riche en leucine (NLR) liant les nucléotides. Il en résulte un changement conformationnel qui à son tour déclenche une cascade de signaux conduisant à des réponses de défense et à une immunité en aval.

Fig. supplémentaires. 1–17.

Tableaux supplémentaires 1 à 20

Modèle tridimensionnel de Sr43, tel que prédit par AlphaFold.

Modèle tridimensionnel de Sr43 avec ATP, comme prédit par AlphaFold.

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Réimpressions et autorisations

Yu, G., Matny, O., Gourdoupis, S. et al. Le gène de résistance à la rouille noire du blé Sr43 code pour une protéine kinase inhabituelle. Nat Genet (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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Reçu : 03 juillet 2022

Accepté : 18 avril 2023

Publié: 22 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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